Izoliranje klona
Općenito, kloniranje se poduzima kako bi se dobio klon jednog određenog gena ili DNA sekvence koja nas zanima. Sljedeći korak nakon kloniranja jest pronalaženje i izoliranje tog klona među ostalim članovima knjižnice. Ako knjižnica obuhvaća čitav genom organizma, negdje unutar te biblioteke bit će željeni klon. Postoji nekoliko načina nalaženja, ovisno o određenom genu. Najčešće se kao sonda koristi klonirani segment DNK koji pokazuje homolognost traženom genu. Na primjer, ako je mišji gen već kloniran, tada se taj klon može upotrijebiti za pronalaženje ekvivalentnog ljudskog klona iz genomske biblioteke čovjeka. Kolonije bakterija koje čine knjižnicu uzgajaju se u zbirci Petrijevih jela. Tada se porozna membrana postavlja na površinu svake ploče, a stanice se pridržavaju membrane. Stanice se rupturiraju, a DNA se odvaja u pojedinačne niti - sve na membrani. Sonda je također odvojena u pojedinačne niti i obilježena je, često radioaktivnim fosforom. Tada se za kupanje membrane koristi otopina radioaktivne sonde. Jednolančana DNA sonda će se pridržavati samo DNK klona koji sadrži ekvivalentni gen. Membrana se osuši i stavi na list filma osjetljivog na zračenje, a negdje na filmovima pojavit će se crna mrlja, koja najavljuje prisustvo i mjesto željenog klona. Klon se tada može naći iz originalnih Petrijevih posuda.
genetika: Rekombinantna DNA tehnologija i lančana reakcija polimeraze
Tehnički napredak igrao je važnu ulogu u napretku genetskog razumijevanja. 1970. američki mikrobiolog Daniel Nathans,
Sekvence DNA
Nakon što je kloniran segment DNK, može se odrediti njegov nukleotidni slijed. Nukleotidna sekvenca je najosnovnija razina znanja gena ili genoma. Nacrt je koji sadrži upute za izgradnju organizma i nijedno razumijevanje genetske funkcije ili evolucije ne bi moglo biti potpuno bez dobivanja ovih podataka.
koristi
Poznavanje sekvence DNK segmenta ima brojne koristi, a slijede neki primjeri. Prvo se može koristiti za pronalaženje gena, segmenata DNA koji kodiraju specifičan protein ili fenotip. Ako je područje DNA sekvencirano, može se ispitati na karakteristične značajke gena. Na primjer, otvoreni okviri za čitanje (ORF-ovi) - dugi nizovi koji počinju sa startnim kodonom (tri susjedna nukleotida; slijed kodona diktira proizvodnju aminokiselina) i neprekinuti su zaustavnim kodonima (osim jednog na njihovom završetku) - predloži a regiju koja kodira proteine. Također, ljudski geni općenito susjedni su takozvanim CpG otocima - nakupinama citozina i gvanina, dva nukleotida koji čine DNA. Ako se zna da se gen s poznatim fenotipom (kao što je gen bolesti u ljudi) nalazi u sekvenciji kromosomske regije, tada nedodijeljeni geni u regiji postaju kandidati za tu funkciju. Drugo, homologne sekvence DNA različitih organizama mogu se usporediti da bi se nacrtali evolucijski odnosi unutar i između vrsta. Treće, genski slijed može se pregledati u funkcionalnim regijama. Da bi se odredila funkcija gena, mogu se identificirati različite domene koje su zajedničke proteinima slične funkcije. Na primjer, određene sekvence aminokiselina unutar gena uvijek se nalaze u proteinima koji obuhvaćaju staničnu membranu; takva rastezanja aminokiselina nazivaju se transmembranskim domenima. Ako se transmembranska domena nađe u genu nepoznate funkcije, to sugerira da se kodirani protein nalazi u staničnoj membrani. Ostale domene karakteriziraju proteine koji vežu DNA. Nekoliko javnih baza podataka o DNK sekvencijama dostupno je za analizu svim zainteresiranim pojedincima.
